ROKA’DAN (Eruca sativa) POLİFENOLOKSİDAZ ENZİMİNİN KARAKTERİZASYONU

Abstract

Yapılan bu çalışmada, Roka’da ( Eruca sativa ) Polifenoloksidaz ( PFO ) enziminin karakteristik özellikleri incelenmiştir. Organik bir bahçede yetiştirilen roka yaprakları distile su ile yıkandıktan sonra 50 mM fosfat tamponu ile blenderda homojenize edilmiştir. Elde edilen karışımdan soğutmalı santrifüj kullanarak ham ekstre elde edildi. Elde edilen ham ekstrede PFO enziminin substrat spesifikliği, optimum pH, optimum sıcaklık, inhibisyon türü, metal iyonlarının etkisi çalışılmış ve protein tayini yapılmıştır. Bu çalışmada enzimin üç farklı substrata ( pirokateşol, gallik asit, kateşin ) karşı ilgisi test edildi. Substratlar 5-30 mM konsantrasyonlarında çalışılarak Km ve Vmax değerleri ( pirokateşol; Km = 10.24 mM, Vmax = 0.0018 U/dk ), ( kateşin; Km = 12.57 mM, Vmax = 0.0012 U/dk ), ( gallik asit; Km = 23.07 mM, Vmax = 0.0001 U/dk ) Lineweaver-Burk grafikleri çizilerek hesaplandı. Yapılan deneyler sonucu enzimin en çok pirokateşol substratına ilgi gösterdiği belirlendi. Polifenoloksidaz enziminin aktivitesi üzerinde pH etkisi, 4.0-10.0 arasında test edildi ve en yüksek enzim aktivitesi pH = 7.0 olarak bulundu. Optimum sıcaklık enzim ( PFO ) aktivitesi için farklı sıcaklıklarda, 20-70 oC arasında 10oC artışlarla test edildi ve en yüksek aktivite 20oC’de bulundu. İnhibitörlerin polifenoloksidaz aktivitesi üzerinde etkisini belirlemek için optimum şartlarda değişik konsantrasyonlarda sitrik asit inhibitörü kullanılarak, Km, Vmax değerleri ve inhibisyon türü Lineweaver-Burk grafiği çizilerek hesaplandı. Çalışılan sitrik asit inhibitörü substratla rekabete girerek yarışmalı inhibisyona sebep olduğu belirlendi. Çalışmamızda 6 farklı metal iyon ( Zn2+, Fe2+, Cu2+, Mn+2, Hg2+, K+ ) kullanılarak enzim aktivitesi ölçülmüştür. Çalışılan metal iyonlarından Zn2+, Cu2+, Mn2+ iyonlarının aktiviteyi arttırdığı, K+ varlığında ise polifenoloksidaz aktivitesinin diğer metallere göre önemli oranda arttığı gözlenmiştir. Fe2+ ve Hg2+ iyonları ise polifenoloksidaz aktivitesini inhibe ettikleri gözlenmiştir. Çalışmamızda Lowry yöntemiyle protein miktarı tayin edildi ve bu yöntemde sığır serum albuminiyle standart kalibrasyon grafiği çizilerek ekstrenin protein miktarı 488 mg/ml tayin edilmiştir.